使用凯氏定氮法测定蛋白质含量【凯氏定氮法测定蛋白质含量】

1、样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳、氢被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵用NaOH中和生成NH3`H2O，加热又分解为氨，用硼酸吸收，吸收氨后的硼酸再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量计算蛋白质的含量。

1、消化　　准备6个凯氏烧瓶，标号。

2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液0mL，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。

3、再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g，浓硫酸0mL，30%过氧化氢0mL。

4、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。

5、6号烧瓶中加入蒸馏水0mL代替样液，其余所加试剂与3号烧瓶相同。

6、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。

7、先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并宏燃吵产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。

8、待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。

9、在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以样品完全消化。

10、消化时放出的气体内含SO具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。

11、整个消化过程均应在通风橱中进行。

12、消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。

13、蒸馏和吸收　　蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。

14、凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。

15、仪器的洗涤　　仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。

16、仪器使用前，段差微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。

17、较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。

18、仔细检查各个连接处，不漏气。

19、首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石(或毛细管等)，以防爆沸。

20、沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。

21、蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸气只能进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。

22、从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。

23、冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。

24、如此清洗2～3次，再在冷凝管下换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。

25、如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。

26、移去锥形瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。

27、无机氮标准样品的蒸馏吸收　　由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，初学者宜先用无机氮标准样品进行反复练习，再进行有机氮未知样品的测定。

28、常用巳知浓度的标准硫酸铵测试三次。

29、取洁净的100mL锥形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基蓝-甲基红混合指示剂(呈紫红色)3～4滴，盖好瓶口待用。

30、取其中一只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。

31、注意、在此操作之前必须先打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。

32、准确吸取2mL硫酸铵标准液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶液慢慢流入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3次，一并放人蒸馏瓶中。

33、然后用量筒向小玻杯中加入10mL30%NaOH溶液，使碱液慢慢流入蒸馏瓶中，在碱液尚未完全流入时，将棒状玻塞盖紧。

34、向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使一半水流入蒸馏瓶，一半留在小玻杯中作水封。

35、关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，进行蒸馏。

36、锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。

37、自变色时起，再蒸馏3～5min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。

38、在一次蒸馏完毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集蔽侍器间的橡胶管，排除反应完毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。

39、如此反复冲洗干净后，即可进行下一个样品的蒸馏。

40、按以上方法用标准硫酸铵再做两次。

41、另取2mL蒸馏水代替标准硫酸铵进行空白测定二次。

42、将各次蒸馏的锥形瓶一起滴定。

43、未知样品及空白的蒸馏吸收　　将消化好的蛋白样品三支，空白对照液三支，依次作蒸馏吸收。

44、加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次，每次用水量约3mL，洗涤液一并倒入反应室内。

45、其余操作按标准硫酸铵的蒸馏进行。

46、由于消化液内硫酸钾浓度高而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，必须加入热蒸馏水5mL稀释之，如果有结晶析出，必须微热溶解，趁热加入玻杯，使其流入反应室。

47、此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未完全冷却时立即加入样品或空白对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，造成堵塞。

48、滴定　　样品和空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。

49、打开接受瓶盖，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的标准盐酸溶液进行滴定。

50、待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。

51、若振摇后复现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在一二分钟内不变，当视为到达滴定终点。

52、若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL，每组样品的定氮终点颜色必须完全一致。

53、空白对照液接受瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。

54、记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数，供计算用。

1、消化　　准备6个凯氏烧瓶，标号。

1、凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

2、即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

3、由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

4、优点、可用于所有食品的蛋白质分析中。

5、操作相对比较简单。

6、实验费用较低。

7、结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。

8、用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质。

9、　缺点、凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。

10、双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。

11、双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

12、当底物中含有肽键时(多肽)，试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。

13、可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。

14、鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。

15、鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

16、优点、测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

17、缺点、①灵敏度差。

18、 ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

19、酚试剂法取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

20、优点、灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。

21、缺点、①费时，要精确控制操作时间。

22、②酚法试剂的配制比较繁琐。

23、紫外吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

24、取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

25、优点、简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。

26、 缺点、①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差。

27、 ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

28、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250定量结合。

29、当考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，其对可见光的大吸收峰从465nm变为595nm。

30、在考马斯亮蓝G-250过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250从吸收峰为465nm的形式转变成吸收峰为595nm的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

31、一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

32、优点、灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。

33、缺点、由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

34、参考资料来源、百度百科-蛋白质测定。

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